熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡是不太常見(jiàn)的顯微鏡，下面上海巴拓儀器有限公司向大家介紹一下熒光顯微鏡的原理。

熒光顯微鏡原理：

    在一百年前，斯托克（STOKES)發(fā)現(xiàn)自然界有許多物質(zhì)能在較短波長(zhǎng)光線(xiàn)照射下，發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光線(xiàn)，也即這些物質(zhì)在被紫外光、紫光、蘭光或綠光照射后，能激發(fā)出藍(lán)色、綠色、黃色或紅色的熒光，叫做光致熒光。

    于是在1911年奧地利科學(xué)家K.Reichert 第一次制成有實(shí)用價(jià)值的熒光顯微鏡，采用碳弧燈作激發(fā)光源，用液體濾光器分離出所需紫外光，采用普通顯微鏡進(jìn)行觀察。

    當(dāng)時(shí)熒光顯微術(shù)對(duì)植物學(xué)及礦物學(xué)利用初級(jí)熒光即可獲得良好的分析效果，但對(duì)于人及動(dòng)物的內(nèi)科研究則不能采用，因?yàn)槿思皠?dòng)物的初級(jí)熒光太弱。

    在1933年，M.Haitinger發(fā)現(xiàn)第二次熒光，把標(biāo)本經(jīng)過(guò)熒光染色處理后，再用短波光線(xiàn)激發(fā)，獲得較強(qiáng)熒光以適應(yīng)對(duì)人及動(dòng)物的研究。

    免疫學(xué)的重要對(duì)象是抗原和抗體的反應(yīng)問(wèn)題，由于抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中一個(gè)因子，也就知道了另一個(gè)因子，用普通染料來(lái)使抗體（或抗原）著色，由于被視覺(jué)所能感知的染料分子的數(shù)量比較大，往往破壞了抗原或抗體的特異活性而不能達(dá)到目的。

    熒光染料它本身是作為一個(gè)發(fā)射體而顯現(xiàn)顏色，可在黑暗背景下觀察，對(duì)人的視覺(jué)有高度靈敏性，只需極微量光線(xiàn)就可在顯微鏡下被感知，這就使熒光染料成為一種合適的標(biāo)記物，它既能使被標(biāo)記的抗體保持原有的特異活性，又能在熒光顯微鏡下被肉眼覺(jué)察。

    熒光標(biāo)本制作過(guò)程是將抗原固定在玻片上，然后用熒光抗體（熒光染料與抗體相結(jié)合)染色一定時(shí)間，以水沖洗，如抗原抗體發(fā)生反應(yīng)造成結(jié)合，則抗體固定在抗原上，否則被水沖去，最后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

    每一種細(xì)菌都有自己的特異抗原，因此，在原則上，應(yīng)用充分的特異的熒光抗體，可以從血清學(xué)上鑒定任何一種細(xì)菌。

    由于熒光染色的色素只需極稀的濃度便能激發(fā)出明亮的熒光，一般對(duì)機(jī)體是無(wú)害的，因而為活體觀察，如研究功能器官的過(guò)程和微細(xì)結(jié)構(gòu)，某些代謝變化的過(guò)程等，提供了廣泛的可能性，另外，熒光色素染色法非常簡(jiǎn)單，需時(shí)短，標(biāo)本制作容易，特別適合于快速工作，如傳染病的快速診斷等。

以下為激發(fā)熒光時(shí)的原理圖：

1. 光源——它提供激發(fā)熒光所需要的足夠強(qiáng)的激發(fā)光（較短波長(zhǎng)光線(xiàn)），通常它是超高壓汞燈(HBO200, HBO100或B050)。采用藍(lán)光激發(fā)時(shí)（FITC)也可用溴鎢燈。

2. 激發(fā)濾光片——它只通過(guò)相應(yīng)標(biāo)本所需要的激發(fā)光，而不需要的光線(xiàn)都遏止掉。

3. 熒光標(biāo)本——被熒光色素染色過(guò)的標(biāo)本。

4. 遏止濾光片——它遏止掉多余的激發(fā)光線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)本中激發(fā)出來(lái)的熒光，便于觀察