顯微鏡如何調(diào)試和使用

顯微鏡如何調(diào)試和使用

   在了解了顯微鏡各主要部件的名稱、構(gòu)造和功能之后，為了更好地發(fā)揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率，保證在顯微觀察及顯微照像過程中取得最佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調(diào)試方法和使用方法。尤其在新一代顯微鏡中，具備了多種功能，能進(jìn)行多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調(diào)方法和使用方法就顯得尤為重要。下面以萬能研究顯微鏡為例，簡述調(diào)試及使用方法。

1.顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整　

    為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調(diào)試時，就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可*結(jié)果的重要手段和最基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟，也是在日常使用過程中不時地檢驗(yàn)顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項內(nèi)容：

(1)照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整

     ① 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素?zé)襞菅b入插座中，安裝時避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔?。悦鉄襞萆狭粲兄讣y等臟物，影響燈泡的使用壽命。

     ② 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔（標(biāo)有“←→”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調(diào)至清晰；然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲位置高低適當(dāng)；再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔（標(biāo)有“──”），使燈絲左右位置合適。

(2)光源發(fā)光體（燈絲）在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)和校正

    目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi)，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件。需要的基本工具：對中望遠(yuǎn)鏡購置顯微鏡時已配備。

    ① 拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒，把燈室裝回顯微鏡上；

    ② 選用10×物鏡，開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰，再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清晰（40×物鏡可以看清燈絲的全貌）；

   ③ 把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到最大；

   ④ 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠(yuǎn)鏡，抓住白色部分，另一手伸縮黑色接目鏡，就可在視野中看到燈絲像；

   ⑤ 如燈絲位置不合適，調(diào)“──”孔，把燈絲像沿水平方向調(diào)好，調(diào)“──”孔，把絲像沿垂直方向調(diào)好，直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像；

   ⑥ 調(diào)整完畢后，將毛玻璃套筒插回原位，拔掉對中望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡作下一步調(diào)整。以上所述照明光源燈室在顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在顯微鏡內(nèi)位置的校驗(yàn)，只需在顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時進(jìn)行，平時使用顯微鏡時不能隨意亂調(diào)亂動。萬一調(diào)亂時，可按上述步驟調(diào)回原狀。

(3)庫勒照明（Kohler）系統(tǒng)的正確調(diào)整

    顯微鏡的正確調(diào)試，主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整，而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整。對于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來說，應(yīng)該對庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發(fā)揮顯微鏡應(yīng)有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是：光源發(fā)光體上任意一點(diǎn)發(fā)出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發(fā)光體上每一點(diǎn)所發(fā)出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實(shí)現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明。調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統(tǒng)造成影響或干擾，以免照像時在底片形成灰霧。高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件：視場光闌、可進(jìn)行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng)。

    ① 選用10×物鏡和10×目鏡；

    ② 把聚光鏡前端透鏡擺進(jìn)光路中，孔徑光闌調(diào)至適中的位置上（不大不?。?，再把聚光鏡升到最頂?shù)奈恢蒙?，聚光鏡轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野“J”位置；

    ③ 把視場光闌調(diào)至最小（0.1）；

    ④ 載物臺上放上已封片的生物樣品，開亮光源，調(diào)焦清晰；

    ⑤ 視域中會出現(xiàn)一個局部照明的區(qū)域或亮斑，這是視場光闌的模糊像，在其中可以清晰地看到樣品的細(xì)節(jié)；在它之外是較暗的視域，不一定能把樣品的細(xì)節(jié)看得清楚；

    ⑥ 把聚光鏡微微地向下調(diào)，使視野中的亮斑逐漸收小，慢慢變成一個清晰的多邊形象，這便是視場光闌的清晰像；

    ⑦ 一般情況下，多邊形象并不在視域中央，需要調(diào)整聚光鏡的一對調(diào)中螺絲，把視場光闌多邊形的像調(diào)至中央位置；

    ⑧ 逐漸開大視場光闌，使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形，進(jìn)一步核對調(diào)中的狀況，如對中不夠理想，繼續(xù)微微調(diào)對中螺絲；

    ⑨ 將視場光闌稍為再微微開大一些，使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上，至此，庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢。庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后，整個視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過程中應(yīng)特別注意： a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小，隨物鏡倍數(shù)的減小而開大； b. 聚光鏡的高低位置不準(zhǔn)亂調(diào)，否則會破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)； c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外，使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中； d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題，在實(shí)際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌，但作顯微照相時，為了避免雜散光線對照相系統(tǒng)的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應(yīng)在使用每一個倍數(shù)的物鏡時，把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復(fù)的工作，但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的視場光闌事先調(diào)整好，并作好記號，以后使用時根據(jù)記號直接調(diào)至相應(yīng)的位置。

(4)孔徑光闌的正確使用　

    由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時應(yīng)掌握正確的使用方法。過去由于對孔徑光闌的認(rèn)識不足，往往把它當(dāng)作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具。雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過程中應(yīng)盡可能避免。為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時，尤其在作顯微照相時獲得最佳分辨率，在每換用一個倍數(shù)的物鏡時，在樣品調(diào)焦清晰后，需要調(diào)節(jié)孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。 調(diào)整方法是用對中望遠(yuǎn)鏡對焦于視野中黑色相差環(huán)上，調(diào)節(jié)孔徑光闌，可以看到一個多邊形的孔徑光闌像，然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2/3，即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間。為方便起見，可把與各倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好，并作好標(biāo)記，以免每次使用都要重新調(diào)整。

   2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要

      顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進(jìn)行的。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。

   (1) 透射光明視野（brightfield）

       這是自顯微鏡發(fā)明以來最傳統(tǒng)、最普遍的應(yīng)用方法?；静考?a.物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察； b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。 注意事項： a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好； b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實(shí)出和擺進(jìn)光路中； c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)； d. 作顯微照相時，每換用一個倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。

   (2) 透射光相差法（phase-contrast）

      這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強(qiáng)法?；静考合嗖钗镧R、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠(yuǎn)鏡、綠色濾光片。調(diào)整方法： a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰；b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對準(zhǔn)轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品； c. 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠(yuǎn)鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）； d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合； e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像； f.有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100物鏡時，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。 適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細(xì)胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

   (3) 微分干涉相襯法（differential interference-contrast，DIC）

       為了克服相差法觀察時樣品細(xì)節(jié)像周圍伴隨有光暈，會掩沒掉本來應(yīng)該看見的細(xì)節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當(dāng)薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設(shè)計子微分干涉相襯法。 調(diào)整方法 a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC方法； b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置； c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應(yīng)為東—西方向； d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與10×物鏡對應(yīng)使用的位置上，即DIC 0.3—0.4； e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DICslider）； f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應(yīng)為南—北方； g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰； h. 調(diào)節(jié)DIC插片，使微分干涉相襯的像達(dá)到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯； i. 同時可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達(dá)到最佳； j. 然后再細(xì)微調(diào)樣品的細(xì)節(jié)，可見樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu)； k. 如果把補(bǔ)色器（first order red retardation plate）插入，并同時調(diào)節(jié)DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍(lán)、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能染色的組織切片，厚度可達(dá)100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細(xì)胞、小生生物等。

   (4) 落射光激發(fā)的熒光法（incident-loghtfluorescence Epi-FL）　

       簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。 熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。

    ① 汞燈的安裝

     a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)； b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定； c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上。 d. 詳細(xì)的安裝方法請參照有關(guān)說明書。

   ② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整： a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min； b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線； c. 轉(zhuǎn)動燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上； d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量*近，但不要重疊在一起。

   ③ 汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗(yàn)：

   a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到最大； b. 把熒光濾光片組推到藍(lán)光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍(lán)光太刺眼； c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙； d. 取下一個物鏡，使激發(fā)的藍(lán)光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會有一藍(lán)色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置。 e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍(lán)光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光； f. 仔細(xì)調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細(xì)節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。

    ④ 汞燈使用注意事項

    目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點(diǎn)燃時，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點(diǎn)燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強(qiáng)光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使用汞燈。 a. 汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電； b. 汞燈在使用過程中，不要隨意開關(guān)汞燈的電源； c. 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時，將會造成嚴(yán)重后果！ 由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強(qiáng)大的電流，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個實(shí)驗(yàn)室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件。 d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當(dāng)可達(dá)600h，使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價格及昂貴，應(yīng)珍惜使用。 e. 汞燈壽命終結(jié)的標(biāo)志是點(diǎn)燃困難，燈管發(fā)黑。 5. 暗視野法（dark field）　許多透明或半透明的樣品，如細(xì)菌、微生物、細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)及結(jié)晶體的內(nèi)含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細(xì)節(jié)。普遍光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為0.2?m，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細(xì)節(jié)構(gòu)造分辨不清楚，但卻可看到0.004?m以上微細(xì)顆粒的存在，即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu)，特別適合用來觀察微細(xì)的顆粒與細(xì)菌等。調(diào)整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好。換上暗視野聚光鏡時，要把載玻片（樣品）移開，將浸沒油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺上，浸沒油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進(jìn)入聚光鏡內(nèi)。對于配備齊全的相差顯微鏡，與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。